Uji Topografi Tetrazolium pada Benih Kacang Tanah dan Kedelai
Uji Topografi tetrazolium adalah uji biokimia yang dapat digunakan untuk menilai viabilitas benih secara cepat. Uji tersebut dilakukan dengan metode pewarnaan menggunakan bahan kimia garam tetrazolium yang dapat memberikan warna merah pada sel. Benih viabel harus menunjukkan pewarnaan pada seluruh jaringan benih yang diperlukan untuk perkembangan kecambah yang normal.
Tujuan Uji Tetrazolium
- Menduga secara cepat viabilitas benih (benih yang harus segera ditanam setelah panen, benih dengan dormansi cukup lama, dan benih yang menunjukkan perkecambahan yang lambat).
- Mengetahui benih viabel dan nonviabel dari benih segar tidak tumbuh pada pengujian daya berkecambah.
- Menyelesaikan masalah yang ditemukan dalam pengujian perkecambahan, jika alasan penyebab kecambah abnormal tidak jelas.
Prinsip Umum Uji Tetrazolium
Pada Uji Tetrazolium, melalui proses hidrogenase terjadi proses reduksi 2,3,5-trifenil tetrazolium klorida yang semula tidak berwarna menjadi trifenil formasan yang berwarna merah dan stabil. Intensitas pewarnaan jaringan digunakan sebagai indikator viabilitas jaringan tersebut. Benih yang hidup akan berwarna merah sedangkan benih yang mati tidak berwarna.
Tahapan Uji Tetrazolium
1. Penyiapan peralatan dan bahan
Peralatan dan perlengkapan yang digunakan adalah:
- Inkubator suhu 20° dan 30°C
- Alat pemotong (skalpel, cutter, silet) dan pinset
- Lup dan/ atau mikroskop
- 2,3,5-trifenil tetrazolium klorida
- Air, akuades atau larutan buffer fosfat untuk melarutkan 2,3,5-trifenil tetrazolium klorida sehingga larutan TZ memiliki pH 6,5 – 7,5
- Larutan TZ disimpan dalam wadah gelap (atau yang dibuat gelap)
2. Pembuatan Larutan 2,3,5 Trifenil Tetrazolium Klorida
- Larutan tetrazolium dibuat dengan konsentrasi 1% dalam larutan buffer fosfat dengan kondisi pH 6,5-7,5
- Pembuatan larutan buffer dilakukan dengan melarutkan 9,078 g KH2PO4 dalam 1000 ml aquades (Larutan 1), melarutkan 9,472 g Na2HPO4 / 11,876 g Na2HPO4.2H2O dalam 1000 ml aquades (Larutan 2)
- Larutan 1 dan 2 dicampur dengan perbandingan 2:3 kemudian pH ditera hingga menunjukkan pH 6,5-7,5. sebaiknya pencampuran dilakukan hanya jika membuat larutan Tetrazolium
- Larutkan 1 g tetrazolium per 100 ml campuran larutan buffer untuk memperoleh larutan tetrazolium 1%
- Larutan tetrazolium disimpan gelap dan tidak boleh terkena cahaya agar tidak terjadi reduksi pada garam tetrazolium
3. Persiapan dan Perlakuan pada Benih
- Benih dilembabkan dengan merendam benih dalam air, dengan tujuan untuk mengaktifkan metabolisme benih
- Pembukaan jaringan benih untuk pewarnaan, dapat dilakukan dengan penusukan benih, pemotongan melintang, pemotongan membujur, pelukaan membujur, pengeluaran embrio, atau menghilangkan kulit benih
4. Pewarnaan Benih
- Pewarnaan dengan merendam benih dalam larutan tetrazolium, dengan lama perendaman berbeda untuk masing-masing spesies
- Waktu pewarnaan dapat diperpanjang bila belum terwarnai dengan sempurna, hindari pewarnaan berlebihan karena dapat mempengaruhi hasil pengamatan
5. Evaluasi/ Pengamatan
- Setelah pewarnaan selesai, harus segera dilakukan pengamatan
- Buang larutan tetrazolium, cuci benih dengan air mengalir hingga bebas dari larutan tetrazolium
- Benih direndam air bersih, amati benih satu persatu menggunakan kaca pembesar atau mikroskop stereo untuk benih yang sangat kecil
Prosedur Uji Tetrazolium pada Benih Kacang Tanah dan Kedelai
Kacang Tanah (Arachis hypogaea)
- Perlakuan pendahuluan: kupas polong, gunakan hanya satu benih, rendam dalam air 18 jam, suhu 20°C
- Persiapan sebelum pewarnaan: Bersihkan kulit ari, pisahkan kotiledon, hanya bagian berembrio yang direndam tetrazolium
- Pewarnaan dengan tetrazolium 1% pada suhu 30°C selama 18 jam
- Evaluasi:
- Perlakuan membuka embrio: potong terutama pada bagian yang tidak terwarnai.
- Max bagian embrio tidak terwarnai yang dianggap viabel: 1/3 radikula, 1/3 distal kotiledon, ½ jika hanya tampak di permukaan
Catatan: Pada verifikasi benih segar uji daya berkecambah, bila kecambah normal telah mencapai 80%, maka dapat digunakan konsentrasi TZ 0,5% selama 24 jam.
Kedelai (Glycine max)
- Perlakuan pendahuluan: benih utuh, lembabkan benih diantara kertas selama 18 jam pada suhu 20°C
- Persiapan sebelum pewarnaan: biarkan benih utuh
- Pewarnaan dengan tetrazolium 1% pada suhu 30°C selama 6 jam
- Evaluasi:
- Perlakuan membuka embrio: Kupas kulit benih untuk mengeluarkan embrio
- Max bagian embrio tidak terwarnai yang dianggap viabel: 2/3 radikula, dari ujung radikula, ½ bagian distal kotiledon
Catatan: Untuk benih keras: kulit benih dapat diiris pada daerah paling ujung kotiledon dan rendam dalam air (4 jam)
Referensi
- BBPPMBTPH. 2021. Aturan ISTA untuk Pengujian Benih 2021 (ISTA Rules 2021), Balai Besar Pengembangan Pengujian Mutu Benih Tanaman Pangan dan Hortikultura (BBPPMBTPH). Depok.
- França-Neto J.B., F. C. Krzyzanowski. 2019. Tetrazolium: an important test for physiological seed quality evaluation. Journal of Seed Science 41(3): 359-366. https://dx.doi.org/10.1590/2317-1545v41n3223104
- Kementan. 2018. Keputusan Menteri Pertanian Republik Indonesia No. 993/HK.150/C/05/2018 tentang Petunjuk Teknis Pengambilan Contoh Benih dan Pengujian/Analisis Mutu Benih Tanaman Pangan.
- Sinaga A.O.Y., M. Lindayanti, P.G. Lestari, D.S.S. Marpaung. 2021. Article Uji Tetrazolium dan Daya Berkecambah Benih Kedelai (Glycine Max L.) Varietas Anjasmoro dan Biosoy 2. Media Agribisnis 5(2):116-122. https://doi.org/10.35326/agribisnis.v5i2
- Sinaga A.O.Y., M. Lindayanti, S.L. Aunila, D.S.S. Marpaung. 2021. Identifikasi Kualitas Benih Kacang Tanah (Arachis Hypogaea L.) Varietas Lokal Tuban Menggunakan Uji Tetrazolium dan Uji Daya Berkecambah. Jurnal Keteknikan Pertanian Tropis dan Biosistem 9(3): 208-215. Doi: https://doi.org/10.21776/ub.jkptb.2021.009.03.02
- Widjayati E., E. Murniati, E.R. Palupi., T. Kartika, M.R. Suhartanto, A. Qodir. 2013. Dasar Ilmu dan Teknologi Benih. IPB Press. Bogor. 173 hlm.
Penulis: Wiwit Rahajeng